Μελέτη και αξιολόγηση της καρκινογένεσης

Η καρκινογένεση μελετάται με διάφορες τυποποιημένες τοξικολογικές δοκιμές. Ένα πρώτο μέρος αυτών των δοκιμών πραγματοποιείται in vitro και - εάν είναι θετικά - προχωράμε σε πειραματισμό in vivo. Αυτή η πειραματική βήμα προς βήμα προσέγγιση ονομάζεται DECISION POINT APPROACH, μια ακολουθία δοκιμών που σταματούν στο τέλος κάθε δοκιμής για να αποφασίσουν πώς θα προχωρήσουν στη δοκιμή. Υπάρχουν πέντε στάδια:

ΦΑΣΗ Α: δομή και χαρακτηριστικά της καρκινογόνου ένωσης.

PHASEB: σε αυτή τη φάση βραχυπρόθεσμων δοκιμών in vitro, χρησιμοποιούνται κύτταρα θηλαστικών. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα κύτταρα είναι τα ηπατοκύτταρα, επειδή μελετάται η έκταση της αποκατάστασης της βλάβης που αναπτύσσει το ηπατοκύτταρο ανάλογα με τη σοβαρότητα της βλάβης που προκαλεί η ουσία. Με λίγα λόγια, δεν προσδιορίζουμε τη βλάβη αυτή καθαυτή, αλλά πόσο από το σύστημα επισκευής έχει ενεργοποιηθεί από το κύτταρο του ήπατος.

Η διαδικασία που εφαρμόζεται είναι ο σχηματισμός 3 ηπατοκυτταρικών καλλιεργειών. Στην πρώτη καλλιέργεια τα ηπατοκύτταρα είναι υγιή, στη δεύτερη υποβάλλονται σε θεραπεία με την υπό δοκιμή ουσία και τέλος στην τρίτη υποβάλλονται σε θεραπεία με ουσία ελέγχου που είναι σίγουρα καρκινογόνος.Αυτές οι τρεις καλλιέργειες περιέχουν μια ραδιενεργή βάση πυριμιδίνης, η οποία είναι τριτιωμένη θυμιδίνη, η οποία δρα ως δείκτης.

Εάν η υπό εξέταση ένωση προκαλεί μετάλλαξη στο DNA, το κύτταρο ανταποκρίνεται σε αυτό το πρόβλημα ενεργοποιώντας τα συστήματα επιδιόρθωσης. Το κομμάτι του DNA που έχει υποστεί τη μετάλλαξη κόβεται και χάρη στη δράση της DNApolymerase το κομμάτι που λείπει αντικαθίσταται με ένα νέο. Για τη διόρθωση, η DNApolymerase χρησιμοποιεί τις νέες βάσεις, συμπεριλαμβανομένης της τριτιωμένης θυμιδίνης. Ενσωματώνεται μια ραδιενεργή βάση. Η ανάλυση της ραδιενέργειας καθορίζει το επίπεδο μετάλλαξης στα κατεργασμένα κύτταρα: όσο μεγαλύτερη είναι η ραδιενέργεια, τόσο μεγαλύτερες είναι οι μεταλλάξεις DNA.

Επίσης στη φάση Β πραγματοποιούνται επίσης δοκιμές σε βακτήρια, για να είναι σε θέση να μελετήσουν εάν υπάρχουν αντίστροφες μεταλλάξεις. Τα βακτήρια που χρησιμοποιούνται είναι σαλμονέλες ήδη φορείς μεταλλάξεων. Η μετάλλαξη αφορά τη σύνθεση ιστιδίνης, οπότε οι σαλμονέλες δεν μπορούν να αναπτυχθούν χωρίς ιστιδίνη. Αυτές οι βακτηριακές αποικίες λαμβάνονται εν μέρει για θεραπεία με την υπό δοκιμή ουσία, εν μέρει για τον αρνητικό έλεγχο και εν μέρει για τον θετικό έλεγχο, και στη συνέχεια δοκιμάζονται με γνωστό καρκινογόνο. Εάν αυτή η δοκιμαστική ουσία είναι έμμεση γονοτοξική, τα ένζυμα μεταβολισμού πρέπει να εισαχθούν στο μέσο καλλιέργειας. Σε αυτό το σημείο υπάρχουν 3 καλλιέργειες που θα σπαρθούν και θα καλλιεργηθούν σε τρυβλία petri (δεν υπάρχει ιστιδίνη στο μέσο καλλιέργειας). Εάν δεν έχουν γίνει μεταλλάξεις από τον καρκινογόνο που πρέπει να δοκιμαστεί, θεωρητικά δεν θα πρέπει να υπάρχουν στις πλάκες Εάν υπήρχε μια μεταλλαξιογόνος δράση του καρκινογόνου, μπορεί να άλλαξε την πρώτη μετάλλαξη και να δημιουργήσει μια δεύτερη μετάλλαξη ικανή να αναπτύξει τα βακτήρια στο μέσο καλλιέργειας χωρίς ιστιδίνη. Σε αυτή την περίπτωση, η δεύτερη μετάλλαξη που τροποποιεί την πρώτη μετάλλαξη και παίρνει το όνομα ΕΠΑΝΑΦΟΡΑΣ Τέλος, εάν εμφανιστεί σημαντική ανάπτυξη στο piasta petri, η καρκινογόνος ουσία είναι άμεση.
Πάντα με μια in vitro δοκιμή είναι δυνατό να προσδιοριστεί η χρωμοσωμική ακεραιότητα. Αυτή η δοκιμή πραγματοποιείται πάντα σε κύτταρα θηλαστικών και χρησιμοποιείται για τον έλεγχο τοξικών ουσιών που μπορούν να προκαλέσουν μεταλλάξεις σε ορισμένα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για τη βιοσύνθεση του DNA. υποβάλλεται σε ανάλυση in vitro Για να είναι σε θέση να προσδιορίσει εάν η υπό εξέταση ουσία επηρεάζει την ακεραιότητα και τον αριθμό των παρόντων χρωμοσωμάτων, χρησιμοποιείται η δοκιμή μικροπυρήνων. Οι μικροπυρήνες είναι κυστίδια που σχηματίζονται με ένα μέρος της χρωματίνης στο εσωτερικό της. Η χρωματίνη που ενσωματώνεται σε αυτούς τους μικροπυρήνες μπορεί να είναι είτε ολόκληρα χρωμοσώματα είτε θραύσματα χρωμοσωμάτων. Οι μικροπύρηνοι σχηματίζονται από λάθος κυτταρική διαίρεση που δημιουργεί θυγατρικά κύτταρα με γενετικό υλικό όχι εξίσου Το αποτέλεσμα αυτής της δοκιμής θα είναι ο προσδιορισμός ουσιών που ορίζονται ως κλαστογόνα και άτρακτα δηλητήρια. Η κλαστογόνος ουσία παράγει μικροπυρήνες με κεντρικά θραύσματα χρωμοσωμάτων, οπότε η ουσία προκαλεί θραύση στα χρωμοσώματα, αντί για την δηλητηριώδη ουσία της ατράκτου τους μικροπυρήνες που υπάρχουν μέσα του ολόκληρα χρωμοσώματα.
Εάν η υπό εξέταση ουσία προκαλεί γονιδιοτοξικότητα σε μία ή περισσότερες δοκιμές, αυτό ορίζεται ως πολύ ύποπτο, οπότε πηγαίνει απευθείας στη φάση Δ. Εάν, από την άλλη πλευρά, η ουσία που δοκιμάζεται δεν προκαλεί καμία γονοτοξική επίδραση, περνά στη φάση της μελέτης Γ επειδή μπορεί να είναι προαγωγέας.

FASEC: σε αυτή τη φάση μπορούν να γίνουν δοκιμές in vitro και in vivo.

Για τις δοκιμές in vitro θα μπορούσε να αποδειχθεί η δυνατότητα της ουσίας προαγωγού να σπάσει τα σημεία σύνδεσης μεταξύ φυσιολογικών κυττάρων και κυττάρων όγκου, με επακόλουθο πέρασμα ουσιών μεταξύ των δύο κυττάρων.

Μια δοκιμή in vivo είναι η πρόκληση όγκων δέρματος σε ποντίκια. Η προς δοκιμή ουσία εφαρμόζεται δύο ή τρεις φορές την εβδομάδα στο δέρμα του ποντικιού. Εντός 2/3 μηνών εάν αυτή η ουσία είναι υποκινητής μπορεί να υπάρχουν σχηματισμοί θηλωμάτων. Στα ποντίκια, εξετάζονται δύο κύρια δεδομένα: ο αριθμός των ποντικών που έχουν προσβληθεί από θηλώματα και ο αριθμός των θηλωμάτων που υπάρχουν σε κάθε ζώο. Εάν η ουσία δρα ως προαγωγέας και αναπτύξει όγκο στο ποντίκι που υποβλήθηκε σε θεραπεία, σημαίνει ότι είναι πράγματι μια ουσία με δράση προαγωγού.

Μόλις ολοκληρωθούν αυτές οι δοκιμές, προχωράμε σε μακροπρόθεσμες δοκιμές in vivo.

FASED: σε αυτή τη φάση ελέγχονται όλες οι ενώσεις που αποδεικνύονται μεταλλαξιογόνες και όλες οι ενώσεις που δεν αποδεικνύονται μεταλλαξιογόνες. Οι εξετάσεις που μπορούν να γίνουν είναι διαφορετικές, μερικές από τις οποίες είναι εξετάσεις που γίνονται στο ήπαρ, στον πνεύμονα και τέλος στο στήθος.

Το ηπατικό τεστ καταδεικνύει τον σχηματισμό όχι ενός νεοσύστατου όγκου, αλλά νεοπλασματικής εστίασης, επομένως κάτι που ετοιμάζεται να γίνει όγκος. Τα κύτταρα αυτής της εστίασης είναι ήδη άτυπα κύτταρα, επομένως έχουν υποστεί μετάλλαξη και ετοιμάζονται να γίνουν νεοπλασματικά κύτταρα. Μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, χάρη στην εξέταση της αυτοψίας, προσδιορίζεται ο σχηματισμός προ-νεοπλαστικών εστιών, υπολογίζοντας τον αριθμό και την έκταση αυτών των προ-νεοπλασματικών σχηματισμών.

Η πνευμονική εξέταση επιτρέπει τον προσδιορισμό ενός αδενώματος, το οποίο είναι μια "ανωμαλία των κυττάρων του πνευμονικού ιστού. Επίσης στην περίπτωση αυτή ο πνευμονικός ιστός του αρουραίου εξετάζεται μετά από αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα (μήνες) (αυτά τα αδενώματα είναι εύκολα αναγνωρίσιμα επειδή είναι υπόλευκα οζίδια στο πνευμονικό επιθήλιο).
Το τεστ μαστού επιτρέπει τον προσδιορισμό των όγκων στον αδενικό ιστό. Ο αριθμός των σχηματισμένων αδενωμάτων και ο αριθμός των ζώων που παρουσιάζουν αδενώματα αξιολογούνται πάντα.

Εάν υπάρχουν θετικά αποτελέσματα από αυτές τις δοκιμές, η υπό δοκιμή ουσία είναι πραγματικά μια καρκινογόνος ουσία. Σε αυτό το σημείο προχωρούμε στη διεξαγωγή ακριβών δοκιμών με πολύ μεγάλους χρόνους εκτέλεσης.

ΦΑΣΗ: σε αυτή τη φάση ένας μεταβλητός αριθμός ζώων, από 20 έως 50, υποβάλλονται σε μακροχρόνιες δοκιμές. μιλάμε για περίπου το 1/8 της ζωής του ζώου.Είναι πιθανό κατά τη διάρκεια αυτών των δοκιμών κάποια ζώα να πεθαίνουν, αλλά μελετώνται πάντα με νεκροψία και ιστολογικό έλεγχο. Τα ζώα που επιλέγονται είναι πάντα αρουραίοι και ποντίκια και μόνο το 70-80% επιβιώνει μέχρι το τέλος των μακροχρόνιων δοκιμών. Τα ζώα που χρησιμοποιούνται είναι απλά απογαλακτισμένα, όσο πιο μικρά είναι, τόσο πιο ευαίσθητα είναι στις θεραπείες. Κατά τη διάρκεια της μακροπρόθεσμης περιόδου δοκιμών, ο ερευνητής υποστηρίζεται πάντα από έναν μαθηματικό-στατιστικολόγο, ικανό να λάβει υπόψη όλες τις πληροφορίες που συλλέγονται και να αναπαράγει τα διάφορα δεδομένα.

Οι δόσεις που δοκιμάστηκαν σε ζώα ξεκινούν από τη μέγιστη ανεκτή δόση και όλα τα υποπολλαπλάσια και η αντίδραση δόσης-απόκρισης στο ζώο αξιολογείται.
Η χορήγηση πρέπει πάντα να προσεγγίζει τη διαδρομή μέσω της οποίας ο άνδρας μπορεί να έρθει σε επαφή με την υπό εξέταση ουσία, επομένως από του στόματος, του δέρματος ή της αναπνευστικής οδού, ενώ εάν η καρκινογένεση ενός φαρμάκου ελέγχεται, είναι επίσης χρήσιμο να γίνει ενδοφλέβια χορήγηση.
Οι ομάδες ζώων που δοκιμάστηκαν είναι 4 (50 ζώα για κάθε ομάδα):

Μια ομάδα NAIF που δεν έχει θεραπεία.
Ομάδα υπό θεραπεία με το όχημα.
Ομάδα υπό αγωγή με την υπό δοκιμή ουσία.
Ομάδα που έλαβε θεραπεία με γνωστό καρκινογόνο.

Είναι πολύ σημαντικό ο αριθμός των ζώων σε κάθε ομάδα να είναι όσο το δυνατόν πιο ίσος. Στην πραγματικότητα, εάν υπάρχει μεγάλη διαφορά στον αριθμό των ζώων, η στατιστική δοκιμή μπορεί να αποδειχθεί ψευδής.
Οι αξιολογήσεις που πραγματοποιούνται είναι:

Συνολική συχνότητα όγκων.
Συχνότητα ορισμένων όγκων.
Συχνότητα ζώων με περισσότερους από έναν τύπους όγκων.
Αριθμός καρκίνων ζώων.

Στο τέλος όλων αυτών των φάσεων μελέτης, η ουσία κατατάσσεται σε κατάταξη που έχει καθοριστεί από το IARC (Διεθνής Οργανισμός Έρευνας και Ανάπτυξης για τον Καρκίνο) και από τον Οργανισμό Προστασίας του Περιβάλλοντος (EPA).